学习真空冷冻干燥技术心得：冻干参数与水的存在形式及冻结过程
本文是蒲公英小学一班微信群里一位研究《真空冷冻干燥技术》的朋友自己做的笔记分享给大家的：了解了冻干技术的原理、冻干机的组成、冻干参数、冻干程序、影响冻干过程的因素、冻干产品不合格的现象及其解决办法。
第三节 冻干参数
水的形式和水的冻结
水是构成生命的重要物质。水在生物系统中以多种形式存在。一种称为游离水，以溶液或悬浮液的形式存在。这种水结冰时会结冰；另一个与一些极性基团形成氢键，并包含在极性基团形成的网络结构中。其中，这部分水即使在极低的温度下也不会结冰，称为结合水；此外，生物系统中还有其他形式的水尚未被了解。
水的结冰过程是这样的：当水的温度降至0℃的冰点时，如果缺少晶核，水就不会结冰。如果温度继续下降，水仍将保持液态。这称为水的过冷；当水中存在一些异物时，异物就成为水结冰的晶核，于是水分子以晶核为核心，按一定的排列组合在一起，形成固体的晶格结构。一旦开始冷冻，温度将从过冷温度迅速升至0℃（由冷冻过程中释放的热量引起），并在冷冻过程中保持在0℃不变。只有当所有的水都结冰后，温度才会持续。衰退。冰晶的数量和大小受两个因素影响；即成核速率和晶体生长速率。当接近0℃时，晶核生长速度加快，成核率很低。因此，在0℃下保存一段时间就会产生大量冰晶。晶体数量少但尺寸大； 0℃以上，低于
当在一定温度下冷冻时，会得到大量的小晶体。
结晶的基本原理
结晶是指溶质从过饱和溶液中自动沉淀形成新相的过程。这个过程不仅涉及溶质分子凝结成固体，而且涉及这些分子在一定晶格中的规则排列。这种规则排列与表面分子化学键力的变化有关。因此，结晶过程也是一种表面化学反应。过程。
当溶液的浓度等于溶质的溶解度时，该溶液称为饱和溶液。当溶质的浓度超过溶解度时，溶液称为过饱和溶液。只有在过饱和溶液中，溶质才能沉淀。众所周知，溶解度与温度有关。一般情况下，物质的溶解度随着温度的升高而增大。有一些例外。例如，红霉素的溶解度随着温度的升高而降低。溶解度与温度的关系可以用饱和曲线和过饱和曲线来表示。
图中的SS线为饱和溶解度曲线，这条曲线下方的区域为不饱和区，称为不饱和区
是一个稳定区。 TT线是过饱和溶解度曲线，这条曲线上方的区域称为不稳定区。 SS线和TT线之间的区域称为亚稳区。
溶液在稳定区内任意一点都是稳定的，无论采取什么措施都不会析出晶体。在亚稳区的任何一点，如果不采取任何措施，溶液都可以长期保持稳定。如果添加晶种，溶质将在晶种上生长，溶液浓度随后下降至 SS 线。亚稳区各部分的稳定性不同。靠近！——！的区域线相对稳定，而靠近SS线的区域容易受刺激而结晶。因此，有人提出将亚稳区分为两部分，上半部分为刺激结晶区，下半部分为晶体生长区。
不稳定区任意一点的溶液都能立即自发结晶，当温度不发生变化时溶液浓度会自动下降到SS线。因此，溶液需要处于亚稳或不稳定区域才能结晶。晶体在不稳定区域中形成得非常快，没有时间生长。浓度下降至溶解度，容易形成大量细小晶体，这对于工业结晶来说是不希望的。为了获得较大且整齐的晶体，通常需要添加籽晶，并控制溶液浓度在亚稳区晶体生长区域内，让晶体缓慢生长，因为有可能自发产生晶体生长区的晶核。非常小。
晶体的产率取决于固体物质和溶液之间的平衡关系。如果溶液不饱和，固体就会溶解。如果溶液饱和，则固体与饱和溶液平衡，其溶解速率等于沉淀速率。只有当溶液浓度超过饱和浓度并达到过饱和时，才有可能结晶。因此，过饱和是结晶过程的驱动力和首要条件。
结晶过程的步骤
结晶是从均匀溶液中沉淀出固相晶体的过程。它通常包括三个步骤：过饱和溶液的形成、晶核的产生和晶体的生长。
1. 过饱和溶液的形成
结晶的第一个条件是溶液必须过饱和。制备过饱和溶液的方法一般有以下(4)种。
(1)冷却结晶这是最简单、最常用的结晶方法，使溶液冷却成为过饱和溶液而析出晶体。例如制霉菌素浓缩液在5℃冷却4-6小时即可完全结晶。晶体沉淀。该方法一般适用于溶解度随温度降低而显着降低的物质。
(2)蒸发结晶：在常压或减压下加热蒸发，除去部分溶剂，使溶液过饱和而结晶。为了防止产品在高温下容易被破坏，生物制药一般采用减压蒸发。例如，赤霉素的乙酸乙酯提取物减压浓缩，除去溶剂后有晶体沉淀。
(3)盐析结晶在溶液中加入某些物质，从而降低溶质在溶剂中的溶解度，使其沉淀。
添加的物质可以是固体或液体。使用常用的盐如氯化钠和硫酸铵以及有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮。例如，在硫酸巴龙霉素浓缩液中加入10-12倍体积、质量分数为95%的乙醇，即可得到硫酸巴龙霉素晶体。
(4)化学反应结晶调节溶液的pH值或添加反应物生成溶解度较小的新物质，使其浓度超过其溶解度而发生结晶。对于一些两性化合物如氨基酸，常利用其在等电点时溶解度最小的原理，只需调节溶液的pH值即可得到晶体。例如，当用盐酸将6.氨基青霉烷酸((6.APA))的钠盐溶液的pH调节至3.8-4.1(等电点附近)时，可以从水溶液中结晶出来。许多抗生素还常用来添加某些成盐剂（试剂），可形成不溶性盐或复盐，从溶液中沉淀、结晶。
上述方法在工业生产中可以单独或组合使用，以提高过饱和度，获得更多的晶体。
2. 晶核的生成
晶核的形成是产生新相的过程，需要一定的能量。溶液中分子的能量或速度具有统计分布的性质，在过饱和溶液中也是如此。当能量因布朗运动而在某一时刻或某一区域暂时达到较高值时，就会析出微小颗粒，即结晶中心称为晶核。原子核继续形成并继续生长成晶体。一般自动成核的机会很少，往往需要借助外界因素来促进晶核的生成，如机械振动、搅拌等。
晶体成核速率与过饱和度和温度有关。在一定温度下，随着过饱和度的增加，成核速度加快。但超过一定值时，溶液分子运动减慢，粘度增大。成核也受到阻碍。在过饱和度不变的情况下，随着温度的升高，成核速度也会加快。但温度也会对过饱和度产生影响。一般来说，当温度升高时，过饱和度降低。因此，温度对成核速率的影响是由温度与过饱和度的相互增减决定的。实际情况是随着温度的升高成核率开始增加。达到最大值后，温度继续升高，成核率反而下降。在工业生产中，结晶过程需要合适的成核速率。如果成核速度过快，势必导致细晶的形成，影响产品质量。
3. 晶体的生长
在饱和溶液中，晶核一旦形成，立即开始生长成晶体，并不断产生新的晶核。因此，所得晶体的尺寸由晶核生成速率和晶体生长速率之间的对比决定。如果晶体生长速率大大超过晶体成核速率，则主要利用过饱和来生长晶体，可以获得粗大、规则的晶体；否则，过饱和主要用于生成新的晶核，所得的晶粒晶体是不均匀的，甚至是非晶态的。在工业生产中，通常希望获得颗粒粗大且均匀的晶体，这样可以使后续的过滤、洗涤和干燥操作更加方便，同时也可以提高产品质量。
影响晶体尺寸的因素主要包括溶液的过饱和度、温度、搅拌速率等。一般来说，随着过饱和度的增加，所得晶体变得更细。温度的影响更为复杂。当溶液快速冷却时，过饱和度较高，所得晶体较细，而当溶液缓慢冷却时，往往得到粗颗粒。搅拌可以促进成核和加速扩散，提高晶体成核生长的速率，但超出一定范围，效果就不显着。相反，搅拌越快，晶体越细。为了获得较粗且均匀的晶体，温度不宜太低，搅拌不宜太快，并控制好晶体成核速率，应低于晶体生长速率。最好将溶液的结晶控制在介稳区，使得在较长时间内只生成一定量的晶核，而原有的晶核继续生长成晶体。
此外，添加晶种还可以控制晶体的形状、大小和均匀性。但首先，籽晶应具有一定的形状、尺寸并且相对均匀。添加晶种还可以降低溶液的过饱和度，诱发结晶，提前生成晶核。因此，在工业生产中，如果结晶液浓度较低，结晶困难时，可以加入适量的晶种，以促进结晶的顺利进行。多糖、蛋白质、酶、核酸等生物高分子物质相对分子质量大、结构复杂、不易定向聚集。它们比普通小分子物质更难形成晶体。它们通常需要通过籽晶来诱导，并且需要时间和能量。还更多。
再结晶
重结晶是将晶体溶解在合适的溶剂中，然后再次结晶，以提高纯度。虽然理论上可以通过结晶得到纯的产品，但实际上，一次结晶得到的产品总是含有一些杂质。这是因为一些与产品溶解度相似的杂质也会部分结晶。有些杂质也会掺入到产品晶体的晶格中，或者由于洗涤不彻底，无法除去晶体中所含的母液，导致晶体被杂质污染。因此，需要进行重结晶以进一步提高产品的纯度。
重结晶的关键是选择合适的溶剂。重结晶所用溶剂一般应满足以下条件：
1、对于需要重结晶的产品有一定的溶解度，但不宜太大。当外界条件发生变化时，其溶解度显着降低；
2、对颜料、降解产物等杂质具有良好的溶解性；
3、无毒或低毒，沸点低，易于回收利用。
重结晶常用的溶剂有蒸馏水、丙酮、甲醇、乙醇等低级醇、石油醚、乙酸乙酯等。如果产物晶体易溶于某种溶剂而难溶于另一种溶剂，而这两种溶剂由于互溶，可用两者的混合溶剂进行重结晶。重结晶的方法是先将产品溶解在溶解度较大的溶剂中，然后慢慢加入第二种溶剂，直至变得微浑浊，即刚刚开始结晶时，然后冷却并放置一段时间完成结晶。
例如，将维生素B12粗晶体溶解在少量蒸馏水中，滤去不溶性杂质，然后加入水溶液体积8-10倍的丙酮直至浑浊，冷却静置两天，即可得较高的产品。可以获得纯度。
结晶和重结晶都是制备纯物质的有效方法。通常只有相似的分子或离子才能规则排列成晶体，因此结晶过程具有很强的选择性。通过结晶，溶液中的大部分杂质将保留在母液中，通过过滤、洗涤等可得到高纯度的晶体。
溶液冷冻
溶液的凝固点和沸点与溶剂和溶质的凝固点和沸点不同。根据溶质浓度的不同，它具有不同的凝固点和沸点。以水溶液为例来说明溶液的缩合过程。水溶液的冷凝与纯水的冷凝不同。在一定的固定温度下不会完全凝结成固体。当溶液温度下降到一定温度时，晶体开始沉淀。随着温度降低，晶体数量不断增加，最后溶液完全凝结。因此，溶液在一定温度范围内会凝结。冷却时晶体开始析出的温度称为溶液的凝固点，溶液完全凝结的温度称为溶液的凝固点，即溶质和溶剂全部结晶的温度点。在溶液的结晶过程中，溶液的浓度会增加，凝固点下降，稀溶液变成浓溶液，并逐渐变成饱和溶液。当温度继续降低时，由于溶解度下降，溶质晶体会析出，最后成为冰晶与溶质晶体的共晶混合物，此时的温度就是溶液的共晶点温度。这个过程也是一个放热过程，也会像水结冰一样出现过冷和结冰曲线上的平台期。
产品的冷冻参数：过冷度、共晶点温度、产品冷冻温度、结晶度。
过冷度：
过冷度是低于冰开始形成的冰冻平衡温度的程度。保持过冷的水可以通过冷冻含有不同成分的配方奶粉来形成冰晶。在过冷条件下，高冰的生长速度与过冷度的平方成正比。高过冷度会增加冰晶的生长速度并形成非常小的冰晶。
产品冷冻温度：将产品冷冻至低于崩解温度10℃的温度；水在冻结温度下的流动性小于0.5。
结晶度 D：配方奶粉冷冻时形成的冰量。
结晶度是产品中形成的冰量与等量水形成的冰量的比率。当产品中的冰量与产品中的可冻结水总量的比率接近0.5时，所得产品块将不会具有海绵状外观，并且对水蒸气流过产品块的阻碍会增加。
共晶点
共晶点的基本定义：在冻结过程中，该温度下溶液的自由度为零。饱和溶液的溶解曲线与溶剂凝固点下降的交点。
需要冻干的产品通常预先制备成水溶液或悬浮液，因此它们的冰点与水的冰点不同。当水在0°C结冰时，溶液的凝固点将低于溶剂的凝固点。此外，溶液的冷冻过程与纯液体的冷冻过程不同。当纯液体（例如水）在 0°C 结冰时，直到所有水都结冰后，水的温度才会下降。这表明纯液体具有固定的凝固点。冰点。解决方案不同。在一定的固定温度下不会完全凝结成固体。相反，在一定温度下，晶体开始沉淀。随着温度的降低，晶体的数量不断增加，直到最后溶液完全凝结。这样，溶液在固定温度下不会凝结。相反，它在一定的温度范围内凝结。冷却时晶体开始沉淀的温度称为溶液的凝固点。溶液完全凝结时的温度称为溶液的凝固点。凝固点是熔化的起点（即熔点）。对于溶液来说，它是溶质和溶剂熔化在一起的点。因此也称为共晶点或共晶点。可以看出溶液的凝固点和共晶点是不同的。共晶点是溶液真正凝固的温度。
显然，共晶点的概念对于冷冻干燥很重要。由于冻干产品可能含有盐、糖、明胶、蛋白质、血细胞、组织、病毒、细菌等，因此，它是一种复杂的液体，其冷冻过程也必然是一个复杂的过程。与溶液类似，它也有一个真正凝结成固体的温度，即共晶点。因为冷冻干燥是在真空下进行的。产品完全冷冻后才能在真空下升华干燥。否则，当有液体存在时，不仅会在真空下迅速蒸发，造成液体浓缩，产品体积缩小；而且溶解在水中的气体在真空下也会很快蒸发。会出现液体沸腾的样子，冻干产品会起泡，甚至从瓶子里冒出来。这是我们不想要的。为此，当冻干产品开始升华时，必须将产品温度冷藏至共晶点以下的温度，使产品真正完全冷冻。
冷冻过程中，无法通过观察外观来判断产品是否完全冷冻成固态；也无法通过测量温度来确定产品的内部结构状态。电气性能随着产品结构的变化而变化是非常有用的。尤其是冻结过程中电阻率的测量可以让我们知道冻结是否正在进行或已经完成。全部冻结后电阻率会很大，所以溶液是离子导电的。当冻结时，离子将被固定而无法移动，因此电阻率显着增加。当存在少量液体时，电阻率会显着下降。因此，测量产品的电阻率将确定产品的共晶点。
产品的共晶点可以通过电阻法、差热分析（DTA）、差示扫描量热法（DSC）以及低温显微镜直接观察来得知。其中电阻检测法价格低廉，目前应用最为广泛。您可以制作自己的测量设备并直接获取数据。
正式的共晶点测量方法是将一对铂电极浸入液体产品中，将温度计插入产品中，冷却至-40℃以下的低温，然后缓慢加热冷冻产品。使用“惠斯通”电桥测量其电阻。当电阻突然降低时，此时的温度就是产品的共晶点。电桥必须用交流电供电，因为电解是用直流电进行的，整个过程都有仪器记录。
也可以通过简单的方法进行测量，将两根适当粗细且彼此绝缘的铜线插入容纳产品的容器中作为电极。将温度计插入铜电极附近，深度与电极相似。将它们放在冻干箱内靠近观察窗的地方，用适当的方法固定，然后与其他产品一起预冻。这时我们用万用表连续测量冷却过程中的电阻值，根据电阻值的变化来确定共晶点。
共晶点是预冻阶段和升华阶段需要控制的温度值。
冷冻干燥升华参数：熔点温度、玻璃化转变温度、崩解温度。
玻璃化转变温度：
当液体温度降低时，液态转变为固态，固态有两种不同的状态：晶态和非晶态。在无定形固体材料中，原子、离子或分子的排列是不规则的。由于人们习惯将熔融物质冷却过程中不结晶的无机物质称为玻璃，其他非晶态逐渐被称为玻璃态。由于药品冻干的要求更加严格，希望药品在冻干过程中低于玻璃化转变温度。但这里的玻璃化温度并不是指完全玻璃化，因为完全玻璃化是指整个样品已经形成玻璃态。实现完全玻璃化需要极高的冷却速率，这几乎是不可能的。冷冻干燥过程中，玻璃化转变温度是指最大冷冻浓缩物的玻璃化转变温度。因为在冷冻过程中，随着冰晶的沉淀，剩余溶液的浓度逐渐增加。当达到一定浓度时，剩余的水不再继续结晶。此时溶液达到最大冷冻浓度状态，相应的温度称为最大冷冻浓缩液。玻璃化转变温度。
塌陷（崩解）温度
塌陷温度是溶质间区域中水的迁移率为零时的温度。对于正常升华的产品，当升华达到一定程度时，就会出现上层干燥层和下层冻结层。这两层之间的界面是升华表面，随着升华的进行，升华表面继续下降。
干燥后的产品应是松散、多孔的，并应保持这种稳定的状态，以便下层冷冻产品升华的水蒸气能顺利通过，使所有产品都能得到很好的干燥。但有些干燥制品的温度升高到一定值后，就会失去刚性，变得粘稠，产生类似塌陷的塌陷现象，使干燥制品失去松散多孔的状态，封住水蒸气。基础冷冻产品的。逃逸路径阻碍了升华的继续。结果，升华速度减慢，并且从冷冻产品吸收的升华热也减少。板层提供的热量将会多余，从而导致冷冻产品的温度升高。当温度升至共晶点以上时，产品可能会熔化或起泡，导致冻干失败。
发生崩解的温度称为产品的崩解温度。此类产品要获得良好的干燥，只有将升华时干品的温度保持在崩解点以下，直至冷冻品完全升华，才能使产品的温度继续升高。此时，由于产品中不存在冻冰，即使干燥产品解体，也不会影响产品的干燥而是影响产品的活性，因为产品已从升华阶段进入解吸干燥阶段。阶段。未崩解的干燥产品和已崩解的干燥产品在外观上没有差异。结构变化只能在显微镜下看到。在显微镜下观察产品的冻干过程时，如果发生崩解，此时的温度就是产品的崩解温度。
有些产品的崩解温度高于共晶点，因此升华时只需控制产品温度低于共晶点即可；但有些产品的崩解温度低于共晶温度，因此可以按一般方法控制升华。如果发生崩解，此类产品只能在较低温度下升华，因此必须延长冻干时间。
产品的共晶点可以通过电阻法、差热分析（DTA）、差示扫描量热法（DSC）和低温显微镜下直接观察得到，但产品的崩解温度只能通过在低温下直接观察得到。冷冻干燥显微镜。知道。产品的崩解温度取决于产品本身的品种和保护剂的类型；混合物质的崩解温度取决于各成分的崩解温度。因此，在选择产品冻干保护剂时，应选择崩解温度较高的材料，以便在不是很低的温度下进行升华干燥，以节省冻干能源和时间，提高生产率。
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